考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的原理、步骤及注意事项

考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的原理、步骤及注意事项

关键词：紫外分光光度计；蛋白质浓度；美析仪器； UV-1100;UV-1200

      蛋白质浓度测定的方法有很多，考马斯亮蓝测定蛋白质是实验室zui常见的一种方式，它利用比色法和色素法混合方法、操作简便，下文介绍了考马斯亮蓝测定蛋白质浓度的原理、优缺点、操作以及注意事项。

实验原理

      考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度zui高的蛋白质测定法。

      考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的zui大吸收峰(lmax)的位置，由465nm变为 595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。

考马斯亮蓝染色法的突出优点是：

      (1)灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其zui低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质-染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。

      (2)测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性。因而*不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。

      (3)干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。

此法的缺点是：

      (1)由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。

      (2)仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠(SDS)等。

试剂与器材

一、试剂

考马斯亮蓝试剂：

考马斯亮蓝G―250 100mg溶于50mL 95%乙醇中，加入100mL 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000mL。

二、标准和待测蛋白质溶液

1.标准蛋白质溶液

      结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用0.15mol/L NaCl配制成1mg/mL蛋白溶液。

2.待测蛋白质溶液。

      人血清，使用前用0.15mol/L NaCl稀释200倍。

三、器材

      试管1.5×15cm(×6)，试管架，移液管管0.5mL(×2);1mL(×2);5mL(×1);恒温水浴;分光光度计,美析UV-1100;UV-1200。

操作方法

一、制作标准曲线

取7支试管，按下表平行操作。

试管编号                      0   1     2       3       4       5       6

标准蛋白溶液（mL）      0  0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06

                              0.1   0.09 0.08 0.07 0.06 0.05 0.04

考马斯亮蓝试剂（mL）        5mL

摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色

A595nm                                                   

绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。

二、未知样品蛋白质浓度测定

      测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的A595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度(mg/mL)。

注意事项

      在试剂加入后的5-20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是zui稳定的。

测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。

       利用考马斯亮蓝法分析蛋白必须要掌握好分光光度计的正确使用，重复测定吸光度时，比色杯一定要冲洗干净，制作蛋白标准曲线的时候，蛋白标准品是从低浓度到高浓度测定，防止误差。