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看完这些就知道超微量分光光度计在核酸定量上的应用了

发布时间:2020-08-04      点击次数:397
  超微量分光光度计是一类很重要的分析仪器 ,无论在物理学、化学、生物学、医学、材料学、环境科学等科学研究领域 ,还是在化工、医药、环境检测、冶金等现代生产与管理部门 ,紫外可见分光光度计都有广泛而重要的应用。
 
  超微量分光光度计已成为现代分子生物实验室常规仪器。常用于核酸,蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。
 
  那么下面让我们来了解一下超微量分光光度计在核酸定量上的应用吧。
 
  核酸的定量是超微量分光光度计使用频率的功能。可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸,单链、双链DNA,以及RNA。
 
  核酸的高吸收峰的吸收波长260 nm。每种核酸的分子构成不一,因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸,事先要选择对应的系数。
 
  如:1OD 的吸光值分别相当于50μg/ml的dsDNA,37μg/ml的ssDNA,40μg/ml的RNA,30μg/ml的Olig。
 
  测试后的吸光值经过上述系数的换算,从而得出相应的样品浓度。
 
  测试前,选择正确的程序,输入原液和稀释液的体积,尔后测试空白液和样品液。然而,实验并非一帆风顺。读数不稳定可能是实验者头痛的问题。灵敏度越高的仪器,表现出的吸光值漂移越大。
 
  事实上,分光光度计的设计原理和工作原理,允许吸光值在一定范围内变化,即仪器有一定的准确度。
 
  这样多次测试的结果在均值1.0%左右之间变动,都是正常的。另外,还需考虑核酸本身物化性质和溶解核酸的缓冲液的pH值,离子浓度等:在测试时,离子浓度太高,也会导致读数漂移,因此建议使用pH值一定、离子浓度较低的缓冲液。
 
  样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素:由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒,尤其是核酸样品。这些小颗粒的存在干扰测试效果。
 
  为了大程度减少颗粒对测试结果的影响,要求核酸吸光值至少大于0.1A,吸光值好在0.1-1.5A。在此范围内,颗粒的干扰相对较小,结果稳定。
 
  从而意味着样品的浓度不能过低,或者过高(超过光度计的测试范围)。后是操作因素,如混合要充分,否则吸光值太低,甚至出现负值;
 
  混合液不能存在气泡,空白液无悬浮物,否则读数漂移剧烈;必须使用相同的比色杯测试空白液和样品,否则浓度差异太大;换算系数和样品浓度单位选择一致;
 
  不能采用窗口磨损的比色杯;样品的体积必须达到比色杯要求的小体积等多个操作事项。
 
  除了核酸浓度,分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度,如A260/A280的比值,用于评估样品的纯度,因为蛋白的吸收峰是280nm。
 
  纯净的样品,比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于1.8 或者2.0,表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。
 
  A230表示样品中存在一些污染物,如碳水化合物,多肽,苯酚等,较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品,A320一般是0。
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