分光光度法米醋总酸量及氨基酸氮含量测定

分光光度法米醋总酸量及氨基酸氮含量测定

关键词：分光光度法；米醋；氨基酸氮；美析仪器; V-1300

米醋的主要成分为醋酸，此外还有少量的其他弱酸。要测定其总酸度，我们可以用NaOH标准溶液滴定，用酚酞作指示剂，从而测得其总酸度。

对于氨基酸氮含量的测定，主要有4种方法：

（1）我们先是使-NH₂与甲醛结合，其碱性消失，破坏内盐的存在，就可以用碱来滴定-COOH基，以间接方法测定氨基酸的量。由于米醋中氨基酸的含量比较少，所以测出的结果准确度较低，选择性较差，滴定终点不易掌握，结果不够理想，而且甲醛会对环境造成污染。

（2）把氨基酸中的-NH₂转化成NH₄⁺，因NH₄⁺的酸性太弱，不能用NaOH标准溶液直接测定，所以用甲醛法进行测定NH₄⁺。甲醛与NH作用生成质子化(CH₂)₆ N₄H⁺和H⁺反应式为：         

（3）氨基酸氮的测定还可以利用Hantzsh反应原理，用乙酰丙酮—甲醛混合溶液作为氨基酸的衍生物，采用吸光度法测定食醋中氨基酸态氮的含量。

（4）电位滴定法根据氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，将酸度计的玻璃电极及甘汞电极（或复合电极）插入被测液中构成电池，用碱液滴定，根据酸度计指示的pH值判断和控制滴定终点。

二、实验原理：

1、关于总酸量的测定

醋酸为有机弱酸（Ka=1.8×10-5）, 与NaOH反应式如下：

        HAc + NaOH = NaAc + H₂O

反应产物为强碱弱酸盐，滴定突跃在碱性范围内，可选用酚酞等碱性范围变化的指示剂。食用米醋中的主要成分是醋酸，其总酸度用HAc的含量来表示。

2、关于食醋中氨基酸含氮量的测定

用甲醛法测氨基酸含氮量

氨基酸具有酸、碱两重性质，因为氨基酸含有-COOH基显示酸性，又含有-NH₂基显示碱性。由于这两个基的相互作用，使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，-NH₂与甲醛结合，其碱性消失，破坏内盐的存在，就可用碱来滴定-COOH基，以间接方法测定氨基酸的含氮量。用碱*中和-COOH基时的PH值为8.4~9.2，可用酚酞作为指示剂，NaOH作为滴定剂。

         氨基酸态氮含量=（N×V×0.014×100%）/W

（N：NaOH标准溶液当量浓渡；V：NaOH标准溶液消耗的总量(m1)；W：样品溶液相当样品重量(克)；0.014：氮的毫克当量。）

用吸光度法测氨基酸含氮量

β-二酮与甲醛的混合试剂与α-氨基酸具有非常灵敏的显色反应。根据Hantzsch反应原理，认为显色产物为3，5-二乙酰-2，6-二甲基-1，4-二氢化吡啶羰酸衍生物，反应式如下：

三、所需仪器、试剂的计划用量及配制方法

仪器：

1.台秤 2.电子天平 3.锥形瓶  4.铁架台  5.移液管  6.烧杯  7.碱式滴定管    8.容量瓶  9.塑料试剂瓶 10.称量瓶  11.量筒  12.酒精灯   13.V-1300型可见分光光度计

试剂：

1、NaOH溶液  0.1mol/L 用烧杯在粗天平上称取4g固体NaOH，加入新鲜的或煮沸的除去CO₂的蒸馏水，溶解*后，转入带橡皮的试剂瓶中，加水稀释至1L，充分摇匀。

2、酚酞指示剂  2g/L乙醇溶液

3、邻苯二甲酸氢钾（KHC₈H₄O₄）基准物质  在100—125℃干燥1h后，置于干燥器中备用。

4、食用醋酸试样

5、中性甲醛溶液18%(1+1)

6、氨氮标准溶液：称量105℃干燥2h的分析纯硫酸铵0.0472克于100mL容量瓶中，混匀，用水稀释成1mg/L

7、显色剂：15mL37%甲醛和7.8 mL乙酰丙酮混合，加水至100 mL

8、缓冲溶液： pH=4.7的NaAc-HAc缓冲溶液，取NaAc83g溶于水加冰醋酸60mL稀释至1L。

9、百里酚蓝指示剂

四、实验步骤

1、0.1 mol/LNaOH标准溶液浓度的标定

在称量瓶中以差减法称量KHP3份，每份0.4—0.5g,,分别倒入2—3滴酚酞指示剂，加入40—50mL蒸馏水，待试剂*溶解后，加入2—3滴酚酞指示剂，用待标定的NaOH溶液滴定至微红色并保持半分钟即为终点，计算NaOH溶液的浓度和各次标定结果的相对偏差。

食用米醋中总酸量的测定

用移液管移取食醋试样20.00mL于100.0mL容量瓶中，用蒸馏水稀释、定容，摇匀。用移液管移取食醋稀释液20.00mL于250mL锥形瓶中，加入25mL蒸馏水，2滴酚酞指示剂，用NaOH标准溶液滴定至溶液由无色变为微红，30s不褪色即为终点，记录消耗NaOH的体积（平行做3次，相对平均偏差应小于0.2%）。根据NaOH标准溶液的浓度和滴定时消耗的体积（V），可计算出食醋中总酸量。

3、甲醛溶液的处理

甲醛中常含有微量酸，应事先中和。其方法如下：取原瓶装甲醛上层清液于烧杯中，加水稀释一倍，加入2～３滴酚酞指示剂，用标准NaOH溶液滴定甲醛溶液至呈现微红色。

4、食用米醋中氨基酸含氮量测定

用移液管取1.00ml上述实验中的 NaOH标准溶液于100ml的容量瓶中、定容、待用。

⑴用甲醛法测定

另取20ml的待测溶液，加入2滴酚酞指示剂，用 NaOH滴加到 刚好颜色变成粉红色30秒内颜色不变化，加入甲醛溶液10mL，再加入百里酚蓝指示剂10滴，用0.001mol/L的 NaOH滴定至蓝紫色，30s内不褪色为终点，记录加入甲醛后消耗NaOH标准溶液的毫升数。

⑵用吸光度法测定

①吸收曲线的制作和测量波长的选择

用吸量管吸取0.0mL和1.0mL氨氮标准溶液分别注入两个50mL容量瓶中，各加入20.0mL缓冲溶液，20.0mL显色剂，水稀释到刻度，混匀。于100℃水浴中加热15min，取出用冷水冷却到室温，移入1cm比色皿，以试剂空白为参比，在360—460nm之间，每隔5nm测一次吸光度，在坐标纸上，以波长λ为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制A与λ关系的吸收曲线，从吸收曲线上选择测定N的适宜波长，一般选用zui大吸收波长。

②标准曲线的制作

在7个50mL的容量瓶中，用移液管分别加入0mL，0.2 mL，0.4 mL，0.6 mL，0.8 mL，1.0 mL1mg/L氨氮溶液，均加入20mL缓冲溶液，20mL显色剂，摇匀，再用水稀释到刻度，摇匀。于100℃水浴中加热15min,取出用冷水冷却到室温。用1cm比色皿，以试剂为参比溶液，在所选择的波长下，测量各溶液的吸光度。以含N量为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。

③食用米醋中氨基酸含氮量测定

用移液管准确吸取适量待测液10mL于50mL容量瓶（或比色皿）中，按标准曲线的制作步骤，加入各种试剂，测量吸光度。从标准曲线上查出和计算试液中铁的含量（单位为μg/mL）

五、数据记录和结果

1、邻苯二甲酸氢钾（KHP）的称重（每份约0.4～0.5g）

2、氢氧化钠溶液浓度的标定

计算公式：C_NaOH= m_KHP/M_KHP×V_NaOH×10^-3

3、食用米醋中总酸量的测定

4、食用米醋中氨基酸氮含量的测定

用甲醛法测定：

计算公式：米醋氮含量=1/10×V_NaOH×C_NaOH*M_N

用吸光度法测定：

1、吸收曲线的制作

2、标准曲线的制作及溶液含铁量的测定

吸取待测液体积（mL）：  10.00mL        

定  容  体  积（mL）：  50mL

在曲线上查得米醋含量： 0.010 ug/mL     

计算原试液中氮的含量： 0.050 ug/mL

六、问题与讨论

1、为什么称取邻苯二甲酸氢钾基准物要在0.4-0.6g范围内？能否少于0.4g或多于0.6g？为什么？

因为一般分析天平的误差为±0.0002g，为了使测量的相对误差在0.1%以下，式样的质量就不可以太小，从相对误差的计算中就可以得到试样的质量必须在0.2g以上，所以称取得质量在0.4g以上可以保证用分析天平的误差在允许的范围之内，又因为在滴定分析中，滴定管读书常有±0.01的误差，在一次滴定中，需要读数两次，因此，可能造成±0.02的误差，所以，为了使测量时的相对误差小于0.1%，消耗滴定剂的用量必须在20.00ml以上，以减小相对误差，所以称取邻苯二甲酸氢钾基准物质的质量在0.4—0.6g以内，可以保证本次实验中滴定邻苯二甲酸氢钾所用的氢氧化钠标准溶液的体积即在20.00以上，又不至于太多，方便操作。

2、加入百里酚蓝指示剂的量可以随意定吗？如果不可以，多少才比较合适？

加入百里酚蓝指示剂的量不同，对滴定终点的观察是有影响的，在上述实验过程当中当滴入百里酚蓝的量为2-3滴的时候，滴定终点的颜色是粉红色的，而且不明显，随着滴数的增加，滴定终点的颜色逐渐明显，当加了12滴左右的时候，滴定终点变成蓝紫色，比较容易观察。

3、实验中测量出来的酸的量可否用ρ_Hac（g.L^-1）表示？

不可以，因为米醋中不仅含有醋酸，还存在其他的酸，因此测出来的酸包含有其他各种形式的酸，所以要用每升溶液中含有氢离子的量来表示。

4、酚酞指示剂由物色变成微红色时，溶液的pH为多少？变红的溶液在空气中放置会变成无色的原因是什么？

酚酞指示剂由物色变成微红色时，溶液的pH为8左右。变红的溶液在空气中放置会变成无色的原因是溶液也会吸收空气中的的二氧化碳等酸性气体，使溶液的PH下降到8以下，所以溶液又会变成无色。

5、 实验中的甲醛的用量是否可以随意加入？是否越多越好？

不是的，当加入的量太少时，-NH2无法充分反应，这时候测出来的值会偏小。而甲醛是致癌物质，无论是吸入蒸汽还是摄入液体都会引起中毒，对眼、皮肤和呼吸器官有强烈的刺激，所以不能用过多的甲醛。

6、参比溶液有什么作用？本实验中的用什么做参比？

用参比溶液来调节仪器的零点，可消除由于吸收池壁及溶剂对入射光的反射和吸收带来的误差，并消除干扰的影响，本实验用空白试剂，即0.0ml的氨氮溶液作为参比溶液。

7、 用吸光光度法测定的时候，温度是否对反应速度有影响？

有影响，本反应随着温度的升高，反应速度加快，当把溶液放在100℃的水浴中加热15min，即显色*，吸光度达到zui高恒定值，当我们把溶液放在室温下，要等一天才能显色*，可见温度对显色是有影响的。

8、显色剂的量是否可以任意加入？

不是的，本实验显色剂加入过少，则显色不明显，但如果显色剂的量过多，又会使显色过深，试剂难以分辨。而且在本实验中，如果加入过多显色剂，待测液的颜色会比任何一瓶标准试剂都深。

9、用吸光光度法和甲醛法测出来的值为什么会有那么大差别？用吸光光度法有什么好处？

因为米醋中氮含量十分少，用甲醛法测定的时候由于用氢氧化钠标准溶液滴定邻苯二甲酸氢钾基准物质的时候有误差，而且滴定含氮量用的氢氧化钠浓度很低，滴定的过程中可能会与空气中的二氧化碳反应，又增大了误差，所以甲醛法的误差比较大，测得的值不太准确。相对来说，吸光光度法就有较高的准确度和精密度，而且本法的操作简便，快速，灵敏，选择性好，更适用于米醋中氨基酸氮含量的测定。