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紫外分光光度法测蛋白酶活力

发布时间:2014-09-19      点击次数:1401

紫外分光光度法测蛋白酶酶活力

美析仪器有限公司

关键词:紫外分光光度法;蛋白酶;美析仪器;UV-1700紫外分光光度计

1、原理 

蛋白酶在一定的温度与pH条件下,水解酪素底物,然后加入三lu.yi.suan终止酶反应,并使未水解的酪素沉淀除去,滤液对紫外光有吸收,可用紫外分光光度法测定。根据吸光度计算其酶活力。酶活单位的定义:每1mL粗酶液,在一定温度和pH值条件下,1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位,以(u/mL)表示。

2、试剂和溶液 

2.1  三lu.yi.suanc(CCL3·COOH)=0.4mol/L 称取三lu.yi.suan65.4g,用水溶解并定容至1000 mL。

2.2  氢氧化钠溶液c(NaOH)=0.5mol/L 按GB601配制。 

2.3  盐酸溶液c(HCL)=1 mol/L及0.1 mol/L 

1 mol/L HCL:取90mL浓盐酸溶解于去离子水中,定容至1000mL。 0.1 mol/L HCL:取9mL浓盐酸溶解于去离子水中,定容至1000mL。 

2.4  缓冲溶液 

a、磷酸缓冲液(pH=7.5)适用于中性蛋白酶 

称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)6.02g和磷酸二氢钠(NaH2PO4·12H2O)0.5g,加水溶解并定容至1000mL。 

b、乳酸缓冲液(pH=3.0)适用于酸性蛋白酶 

甲液  称取乳酸(80%~90%)10.6g,加水溶解并定容至1000 mL。 乙液  称取乳酸钠(70%)16g,加水溶解并定容至1000 mL。 

使用溶液  取甲液8 mL,加乙液1 mL,混匀,稀释一倍,即成0.05moi/L乳酸缓冲溶液。 

c、硼酸缓冲溶液(pH=10.5)适用于碱性蛋白酶 

甲液  称取硼酸钠(硼砂)19.08g,加水溶解并定容至1000 mL。 乙液  称取氢氧化钠4.0g,加水溶解并定容至1000 mL。 

使用溶液  取甲液500 mL、乙液400 mL混匀,用水稀释至1000mL。 上述各种缓冲溶液,均须用pH计校正。 

2.5  10g/L酪素溶液称取酪素1.000g,至0.001g,用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液(若酸性蛋白酶则用浓乳酸2~3滴)湿润后,加入适量的各种适宜pH的缓冲溶液约80 mL,在沸水浴中边加热边搅拌,直到完全溶解,冷却后,转入100 mL容量瓶中,用适宜的pH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存,有效期为三天。 

2.6 100ug/mL L-酪氨酸标准溶液 

a、称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g,至0.0002g,用1mol/L盐酸60 mL溶解后定容至100 mL,即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。 

b、吸取1mg/ mL酪氨酸标准溶液10.00 mL,用0.1mol/L盐酸定容至100 mL,即得到100ug/ mL L-酪氨酸标准溶液。此溶液在冰箱内贮存或立即使用。 

3  仪器和设备 

3.1  恒温水浴40±0.2℃。 

3.2  美析紫外分光光度计UV-1700。 

4  分析步骤 

4.1  求K值 

按下表配制不同浓度的L-酪氨酸标准溶液,然后,直接用紫外分光光度计于275nm测定其吸光度(A),以吸光度A为纵坐标,酪氨酸的浓度c为横坐标,绘制标准曲线(此线应通过零点), 根据作图或用回归方程,计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量(μg),即为吸光常数K值;(其K值应在(130~135)范围内)。 管  号 

酪氨酸标准溶液的浓

度 (μg/mL) 

取100ug/mL酪氨酸标准溶液的体积 

mL 

取水的体积 

mL 

吸光值 Abs. 0 0 0 10  1 10 1 9  2 20 2 8  3 30 3 7  4 40 4 6  5 50 

4.2 测定 

吸取适量稀释的酶液2.00mL、酪素2.00mL、三lu.yi.suan4.00 mL,其它操作条件同福林法测定中的反应、静止沉淀,直到过滤。滤液用紫外分光光度计,在275nm波长下,用10mm比色皿,测定其吸光度(A)。 

a、先将酷素溶液放入40±0.2℃恒温水浴中,预热5min; 

b、按下列程序操作: 

 试管A(空白)试管B(酶试样,需作三个平行试样) 加酶液2.00 mL 加酶液2.00 mL 40±0.2℃,2min 40±0.2℃,2min 

加三lu.yi.suan4.00 mL(摇匀)加酪素2.00mL(已预热)(摇匀) 40±0.2℃,10min(计时)40±0.2℃,10min(计时) 加酪素2.00mL(已预热)(摇匀)加三lu.yi.suan4.00mL(摇匀) 继续加热10min,过滤或离心继续加热10min,过滤或离心 于275nm波长,测上清液吸光值于275nm波长,测上清液吸光值 

c、1.398和166蛋白酶,除反应与显色温度为30±0.2℃外,其它操作同 4.2。标准曲线作同样处理。 

5  计算 

在40℃下每毫升酶液每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸,定义为1个蛋白酶活力单位。 

X=A×K×8/2×1/10×n×E=2/5×A×K×n×E 

式中:X——样品的酶活力,(u/mL); 

      A——试样溶液的平均吸光度;       K——吸光常数; 

      8——反应试剂的总体积,mL;       2——吸取酶液2.00mL; 

      1/10——反应时间10min,以1min计;       n——稀释倍数 

      E——紫外法与福林法的换算系数(中性、碱性蛋白酶系数为0.50;酸性蛋白酶系数

为0.77)。 

所得结果表示至整数。 6 结果的允许差 

平行试验测定值之差不得超过3%。

 

关键词:紫外分光光度法;蛋白酶;美析仪器;UV-1700紫外分光光度计

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